Poly (A) 聚合酶，E.coli

制品说明：
Poly (A)聚合酶（E.coli）催化由 ATP转化而成的AMP添加到RNA 3’羟基端，该反应需要Mg2+，而不依赖模板的存在。

用途：
·用ATP或虫草素（cordycepin）进行RNA 3’末端标记
·RNA末端加Poly (A)尾，用于克隆或亲和纯化
·提高转染至真核细胞中的RNA的翻译效率

来源：
重组E. coli菌株，含有E.coli Poly（A）聚合酶表达载体的E.coli菌株。

随酶提供：
10X Poly (A) Polymerase Reaction Buffer

10X Poly (A) Polymerase Reaction Buffer
500 mM Tris-HCl
2.5 M NaCl
100 mM MgCl2
pH 7.9，25°C保存

单位定义：
1单位指37 ℃条件下，10分钟催化1 nmol的ATP掺入酸性不溶物所需要的酶量。

核酸污染检测
单链 核酸外切酶活性：
在50μL反应体系中，10μL酶溶液和10,000 cpm放射性标记的单链DNA底物作用，37℃孵育4小时，溶液中可溶性TCA的释放量 小于5%。

双链 核酸外切酶活性：
在50μL反应体系中，10μL酶溶液和5,000 cpm放射性标记的双链DNA底物作用，37℃孵育4小时，溶液中可溶性TCA的释放量 小于1%。

双链 核酸内切酶活性：
在50μL反应体系中，10μL酶溶液与0.5μg pBR322 DNA作用，37℃孵育4小时，经琼脂糖凝胶电泳，无肉眼可见的环状切口DNA出现。

非特异性RNAse检测：
按RNAse Alert试剂盒（Integrated DNA Technologies）用户手册的方法检测。

E.coli 16s rDNA污染检测：
将5μL酶溶液进行变性，用16s RNA基因位点的寡聚核苷酸引物，进行TaqMan qPCR分析，筛选并检测E.coli基因组DNA污染物的存在。根据无模板对照的Ct值和标准曲线之间的比对，本检测的下限可达到10个拷贝/样品。

质量控制分析
单位定义方法：
酶的单位活性是 通过2倍连续稀释法测得的。用1XReaction Buffer（50mM Tris-HCl, 250mM NaCl, 10mM MgCl2, pH 7.9 @ 25°C）稀释本酶，加入到含20μg 15-mer RNA Oligo，1X Reaction Buffer，1 mM ATP, 和0.007 μCi/mL 3H-ATP的50μL反应体系中，Poly（A）聚合酶的终浓度0.00118~0.022μg/μL。37℃条件下孵育10分钟，冰浴后进行1%的琼脂糖凝胶电泳，然后按照Sambrook and Russell的方法进行分析（Molecular Cloning, v3, 2001, pp. A8.25-A8.26）。酶的浓度与参考样品的浓度在统计学上一致。

蛋白浓度测定（OD280）：
标准操作下，2.0μL蛋白样品，以2.0mg/ml BSA标准样（Pierce Cat#23209）为阳性对照，产品保存液为空白对照，经Nanodrop ND-1000 分光光度计测定OD280值。3次检测的平均值，根据吸光系数转换为52,060 mg/mL，分子量为53,870Da。标准样品的允许误差为±5%。

SDS-PAGE（物理纯度检测）
4-20%的变性Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶，取2.0μL浓缩酶上样，两侧分别取能够分辨分子量范围较大的蛋白Marker和2.0μL 100倍稀释的待测酶上样。凝胶电泳后进行染色，通过比较上样样品确定酶的纯度。本次检测的验收标准为，当浓缩样品中的污染物条带的总质量不超过稀释样品中的目的条带的蛋白质的质量时，可判定浓缩样品的浓度大于95%。

推荐贮存条件：
-20℃